ELISA检测试剂盒中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA检测试剂盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
ELISA检测试剂盒中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育（incubation），有人称之为孵育，在ELISA检测试剂盒中似不恰当。
ELISA检测试剂盒常压灭菌操作要点:
(1)进锅不挤压：摆放待灭菌的菌种袋必须分层，每层菌种袋不可摆太挤，要留一定空隙，不能相互挤压。不适宜将菌种袋卧叠，要分层立放，以保证蒸汽畅流和接种穴完好。为了避免棉塞易潮湿，可在棉塞上盖一层薄膜或油纸，但覆盖物不可太大，否则会影响上下层蒸汽畅流；也可将4个菌种袋的棉塞并拢，棉塞向下一同塞到4个菌种袋的空隙中，这样塑料袋规格要加长，但防潮效果良好。
(2)及时灭菌：随装随灭。配料到灭菌间隔时间越短越好，以免杂菌自繁。大规模生产时，要分锅灭菌。
(3)攻头：指开始灭菌时要大火猛烧。从开始灭菌到温度达100℃，历时越短越好，不能超过2小时，以免长时间高温高湿造成杂菌自繁。当然，ELISA检测试剂盒要做到这一点还取决于灭菌锅的保温保气性能。
(4)控中间：指锅体下部温度达到100~C后，控制火势烧稳火，维持8～10小时。此间，温度不可回落，灭菌操作者要坚守岗位，不能因通宵灭菌、疲劳或其他原因而懈怠，引起温度回落。另外，常压灭菌为了避免烧干应注意及时向蒸发锅内补充水，但补水不能造成锅内水停止沸腾，可考虑补充沸水或微量连续补水。可见，要想节省燃料，又要做到上述这些，建造一个保温、保汽性能良好的灭菌锅十分重要。
(5)保尾：指灭菌结束前要再一次大火猛烧。目的在于加大蒸汽量，灭菌结束后打开柜门时有大量蒸汽冒出，带走棉塞湿气。但此时要将连体灭菌锅中蒸发锅内的水排干。在开门时先将门拉开一条缝隙散气，烘干棉塞，避免冷热接触产生冷凝水使棉塞受潮。
