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多重荧光探针PCR检测试剂盒的使用方法

更新日期: 2022-09-23
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1.样品处理(样本处理区)
1.1样本前处理
每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g,手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中,8000rpm 离心2min,取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中;棉拭子直接取100μL提取。
1.2RNA提取
推荐采用RNA提取试剂盒(离心柱提取法),请按照试剂盒说明书进行操作。
2.试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照;样品每满7份,多配制1份),每测试反应体系配制如下表:
试剂AIV-H7N9 反应液 酶液
用量20μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到PCR反应管中,21uL/管。
3.加样(样本处理区)
将步骤1提取的RNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。
4.PCR扩增(核酸扩增区)
4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR 仪反应槽内;
4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为25μL;荧光通道选择:检测通道(Reporter Dye)FAM、CY5,淬灭通道(Quencher Dye)选择NONE,ABI系列仪器请勿选择ROX参比荧光,选择None即可。
4.3推荐循环参数设置:
步骤循环数温度时间收集荧光信号
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1cycle 95℃ 10min 否
3 40cycle 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.结果分析判定
5.1结果分析条件设定
设置Baseline和Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop 值(一般可在5~20范围内调节),以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
5.2结果判断
FAM通道为禽流感病毒H7N9亚型H7基因检测结果,CY5通道为禽流感病毒
H7N9亚型N9基因检测结果
阳性:检测通道Ct值≤35.0,且曲线有明显的指数增长曲线。
可疑:检测通道Ct值>35.0,且出现明显扩增曲线的样本建议重复试验,重复试验结果出现Ct值≤35.0和明显扩增曲线者为阳性,否则为阴性。
阴性:样本检测结果无Ct值且无明显的扩增曲线。
6.检测方法的局限性
样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定
量检测不准确的结果;
本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
7.质控标准
阴性质控品:无明显扩增曲线且无Ct值显示;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且Ct值≤32;
以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
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