荧光探针法PCR试剂盒利用吸附柱提取RNA作为模板，在反转录酶的作用下，以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链；然后在DNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环，使特异DNA片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA片段进行电泳、染色后，在紫外灯下，肉眼可见DNA片段的扩增带。
一、样品制备
样品采集：：病死或扑杀的禽，取肺、脾、脑等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物，放于50%甘油生理盐水中或用注射器取血5mL，2～8℃保存。(要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。)
组织样品的处理：称取组织0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取100µL上清于1.5mL灭菌离心管中。2样品处理：
全血样品的处理：待血凝后取100µL血清于1.5mL灭菌离心管中。
阳性对照的处理：取阳性对照100µL于1.5mL灭菌离心管中。
阴性对照的处理：取阴性对照100µL于1.5mL灭菌离心管中。
二、病毒RNA的提取
取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入450µL裂解液，充分颠倒混匀，室温静置3min。
加入275µL无水乙醇，轻轻混匀。
将混合液吸入吸附柱中(吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱)，10,000rpm离心1min，弃去收集管中液体，套回收集管。
向吸附柱中加入500µL洗涤液A，10,000rpm离心1min，弃去收集管中液体，套回收集管。
向吸附柱中加入500µL洗涤液B，10,000rpm离心1min，弃去收集管中液体，套回收集管。
空柱10,000rpm离心2min。
将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5mL离心管中，在膜中央加入30µL洗脱液，室温静置2min，10,000rpm离心1min，获得总RNA。
三、RT-PCR
反应体系：分别取14µLRT-PCR反应液A(用前混匀)、4µLRT-PCR反应液B(用前混匀)和2µL模板RNA，混匀。
反应程序：在PCR仪上运行以下程序：42℃45min，94℃3min；94℃30s、53℃30s、72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。
四、电泳
制胶：用50倍稀释的TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。
电泳：待胶凝固后，取5µLPCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm的电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳。
染色：取50倍稀释的TAE电泳缓冲液30mL，加入10µL染色液，混匀后将胶浸泡30min，于紫外灯下观察结果。
【结果判断】
阳性对照出现400bp扩增带，阴性对照无带出现(引物带除外)时，实验结果成立。被检样品出现400bp扩增带为新城疫病毒阳性，否则为阴性。
【需用但未提供的材料】
组织研磨器、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、琼脂糖、经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌1.5mL离心管和吸头(10µL、200µL、1000µL)。
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更新时间：2026-04-23
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