猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒使用说明书
【试剂盒简介】
猪瘟病毒RT-PCR试剂盒,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR )技术检测疑似感染动物血清或组织中的CSFV,适用于CSFV 的检测、诊断和流行病学调查。该试剂盒不能区分强弱毒。
【原理】
利用吸附柱提取RNA作为模板,在反转录酶的作用下,以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA链;然后在DNA 聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环,使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA 片段进行电泳、染色后,在紫外灯下,肉眼可见DNA 片段的扩增带。
【试剂盒组份】
1. 生理盐水 | 20mL | 8. 吸附柱和收集管 | 10套 |
2. 裂解液 | 6mL | 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15个 |
3. 洗涤液A | 7mL | 10. RT-PCR 反应液A | 180μL |
4. 洗涤液B | 7mL | 11. RT-PCR 反应液B | 50μL |
5. 洗脱液 | 500μL | 12. 50 倍TAE 电泳缓冲液 | 20mL |
6. 阴性对照 | 300μL | 13. 染色液 | 10μL |
7. 阳性对照 | 300μL |
注:塑料袋内试剂(阳性对照、RT-PCR反应液A和B)-20 ℃冻存,裂解液2-8℃冷藏,其他室温保存。
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【操作方法】
一、样品制备
1样品采集:病死或扑杀的猪,取肺、扁桃体和脑等组织;待检活猪,用注射器取血5 mL,2~8 ℃保存。(要求送检病料新鲜,严禁反复冻融。)
2样品处理:
2.1 组织样品的处理:称取组织0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理盐水继续磨至无块状物;然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中,8000 rpm离心2 min,取100 µL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。
2.2 全血样品的处理:待血凝后取100 µL血清于1.5 mL 灭菌离心管中。
2.3 阳性对照的处理:取阳性对照 100 µL于1.5 mL 灭菌离心管中。
2.4 阴性对照的处理:取阴性对照100 µL于1.5 mL 灭菌离心管中。
二、病毒RNA的提取
1. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照,分别加入450µL裂解液,充分颠倒混匀,室温静置3min 。
2. 加入275µL无水乙醇,轻轻混匀。
3. 将混合液吸入吸附柱中(吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质,以免离心时堵塞吸附柱),10,000 rpm 离心1min,弃去收集管中液体,套回收集管。
4. 向吸附柱中加入500µL洗涤液A,10,000 rpm 离心1min,弃去收集管中液体,套回收集管。
5. 向吸附柱中加入500µL洗涤液B,10,000 rpm 离心1min,弃去收集管中液体,套回收集管。
6. 空柱10,000 rpm 离心2 min。
7. 将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5 mL离心管中,在膜中央加入30µL洗脱液,室温静置2min,10,000 rpm 离心1min,获得总RNA。
三、RT-PCR
1. 反应体系:分别取14µL RT-PCR反应液A(用前混匀)、4µL RT-PCR反应液B(用前混匀)和2µL模板RNA,混匀。
2. 反应程序:在PCR仪上运行以下程序:42 ℃ 45 min,94 ℃ 3 min ;94 ℃ 30 s 、53℃ 30 s 、72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃延伸10 min。
四、电泳
1. 制胶:用50倍稀释的TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。
2. 电泳:待胶凝固后,取5µL PCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm的电压于50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液中电泳。
3. 染色:取50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液30mL,加入10µL染色液,混匀后将胶浸泡30min,于紫外灯下观察结果。
【结果判断】
阳性对照出现494bp扩增带,阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品出现494bp扩增带为猪蓝耳病毒阳性,否则为阴性。
【需用但未提供的材料】
组织研磨器、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、琼脂糖、经焦碳酸二乙酯(DEPC )处理的灭菌1.5mL 离心管和吸头(10 µL、200 µL、1000 µL)。
【注意事项】
1.本试剂盒有效期为6个月,不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的组分不要混用。
2.所有试剂应在规定的温度储存,使用时拿到室温下,使用后立即放回。
3.注意防止试剂盒组分受污染。使用前将塑料袋内试剂瞬离15s,使液体全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。
4.严格按试剂盒说明书操作可以获得的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。
5.RNA提取过程中,应戴口罩、勤换手套,尽量缩短操作时间。
6.所有接触病料的物品均应合理处理,以免污染实验室。
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