结核杆菌（TB）荧光PCR核酸扩增检测试剂盒

结核杆菌(TB)荧光PCR核酸扩增检测试剂盒说明书

【产品名称】

通用名称：结核杆菌(TB)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)

Name  ：Tubercle Bacillus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

4.1结核病是由结核杆菌（Tubercle bacillus， TB）引起的传染性疾病，可累及全身多个器官，但以肺结核为常见。据世界卫生组织报道，*有超过三分之一的人口被致病菌结核分枝杆菌所感染，其中约10%的人们在其有生之间将面临活动性结核病的困扰[1]。而在这些结核病患者中，每年有200万人丧生。虽然有抗菌药物，但其疗程至少要6个月，且花费巨大，由于经济等原因而常常使患者无以为继[2]。本试剂盒适用于检测人气管分泌物拭子、肺组织等样本中的结核杆菌，用于结核杆菌感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，设计一对结核杆菌特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对结核杆菌的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

名      称   规      格

核酸提取液           1.5mL×2管

酶液        50μL×1管

TB反应液       1.0mL×1管

TB阳性质控品       50μL×1管

阴性质控品      250μL×1管

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过5次，有效期12个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。

【标本采集】

    无菌采集人肺病变部位或病变/非病变部位交界处的样品；或用灭菌棉拭子沾取人气管分泌物，放入无菌试管中。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；气管分泌物取100μL提取。

1.2DNA提取

1)对上述处理好的标本加入等体积核酸提取液（固体标本加入50μL核酸提取液），100℃恒温处理10min，13,000 rpm离心5min，取上清液转移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；

2)DNA的提取也可以采用上海晅科生物科技股份有限公司生产的DNA提取试剂盒（离心柱提取法），请严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂 TB反应液 酶液

用量（样本数为N） 20μL 1μL

将混合好的测试反应液分装到PCR反应管中，21uL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR扩增（核酸扩增区）

4.2将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；

4.3设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列仪器请勿选择ROX参比荧光，选择None即可。

4.4推荐循环参数设置：

步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道Ct值≤35.0，且明显的扩增曲线。

可疑：检测通道Ct值>35.0，且出现明显曲线的样本建议重复试验，重复试验结果如果同样出现Ct值≤35.0和明显扩增曲线则为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无Ct值且无明显的扩增曲线。

6. 检测方法的局限性

1）样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2）样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3）阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4）病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5）不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6）试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7）本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

7.质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线或无Ct值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，*混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

Ø[1] Anon, W. H. O. (2006). Global Tuberculosis Control, Surveillance, Planning, Financing. Geneva: WHO, 1-242.

Ø[2] Russell, D. G. (2007). Who puts the tubercle in tuberculosis? Nat Rev Microbiol 5, 39-47.

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