elisa酶联免疫试剂盒科普

　　一、简介
 

　　elisa酶联免疫试剂盒是酶免疫测定技术中应用很广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
 

　　二、成分
 

　　试剂盒内包括以下试剂：
 

　　1.酶标板(96孔板)
 

　　2.血清检测抗体试剂(固定在小板上)
 

　　3.特异性标记兔抗人IgG辣根过氧化物酶(HRP)
 

　　4.HRP底物染色液
 

　　5.固定酶标板的NaCI-Pi缓冲液
 

　　6.去污液
 

　　7.色谱纯洗板缓冲液
 

　　三、样本类型
 

　　本试剂盒可检测不同种类的生物样本，包括：血清、血浆、组织抽提物、阳性参考样本、阴性对照样本等。不过首先要保证样本与试剂之间无相互干扰。
 

　　四、储藏
 

　　应于2-8℃的阴凉干燥处存放。如需长期贮存，应冷冻保存(-20℃或-80℃)。
 

　　五、试剂准备
 

　　1.酶标板制备：首先，在每个空白小孔板的每个孔中，添加50μL的PBS(0.01M)。然后将板放入一个旋转式混合器中，温和混合，管孔覆盖在对应的坑孔区域上，将坑孔以180度反转，然后在抽走液体后，再次将坑孔埋入缓冲液中，丢弃PBS。最后，将板于坑孔中添加100µl的固定抗体，每个备件(坑孔)尽可能多添加固定抗体。
 

　　2.样品制备：将样品与样品稀释液按照比例混合。
 

　　3.销量质控制备：将阳性参考样本与阴性对照样本准备好。
 

　　六、操作步骤
 

　　1.将酶标板每个小孔内填充50µL固定酶标记性抗体时，将板制备至2-8℃下存储20小时。
 

　　2.将液态样品溶于样品稀释液中，使样品达到适合检测的浓度。样品应避免过度稀释或过度浓缩。
 

　　3.然后，向每个小孔中加入50µl的稀释后的样品，以及50µl的阳性参考样本、50µl的阴性对照样本。
 

　　4.使用封板膜密封，并在37℃恒温箱中孵化60分钟。
 

　　5.丢弃所有的液体，并在试剂盒内水龙头下冲洗各个小孔以清除未被绑定的物质。
 

　　6.将200υl洗板缓冲液加入每个小孔中，用废液槽放置一段时间后，倒掉，重复此操作至少3次。
 

　　7.向每个小孔中加入50µl的HRP标记羊抗人IgG，孵化37℃下30分钟。
 

　　8.重复步骤6以清除未结合的物质。
 

　　9.将50µl的HRP底物添加到每个小孔，并在黑暗中置于室温静止15分钟。
 

　　10.停止反应，加入50µl停止液应用于每个孔中。
 

　　11.读取OD值测量各小孔校准曲线，计算样本的质量浓度。
 

　　七、规范化操作流程与关键质控点
 

　　遵循规范化流程并严控关键节点，是获得CV(变异系数)合格、可靠数据的保障。
 

　　A. 实验前准备与试剂平衡
 

　　试剂回温：将所有试剂盒组分从4℃取出，在室温(20-25℃)下放置至少30分钟，以达到温度平衡。这能有效减少因温度差异导致的孔间变异。
 

　　洗涤液配制：若提供浓缩洗涤液，需用去离子水或蒸馏水按说明书比例精确稀释，并充分混匀。浑浊或未全部溶解的洗涤液会堵塞洗板机。
 

　　B. 加样与孵育关键
 

　　加样技巧：使用校准过的移液器，枪头垂直插入孔底(避免触碰底部包被物)，缓慢加入样品或试剂，避免产生气泡。建议对标准品和样品进行复孔检测。
 

　　孵育条件：严格按说明书控制温度(通常是37℃)和时间。孵育时，必须使用封板膜密封，防止液体蒸发和孔间交叉污染。避免孔板叠放过高导致受热不均。
 

　　C. 洗涤——最易被忽视的成败关键
 

　　洗涤要点：洗涤是去除未结合物质、降低背景信号的核心。若用洗板机，应定期校准吸液、注液量；若手工洗板，需注意：
 

　　弃液后，将板在干净吸水纸上拍干，以去除残留液。
 

　　每孔加满洗涤液，静置30-60秒后再弃去，重复规定次数(通常3-5次)。
 

　　最后一次洗涤后，务必将孔内液体拍干，但不可让孔壁干燥过久。
 

　　D. 显色与终止
 

　　显色(避光)：加入底物液后，需在避光条件下孵育。显色时间需严格控制，可观察阳性孔颜色变化(通常为蓝色)来决定终止时机，避免显色过度导致“高钩”效应。
 

　　终止与读数：加入终止液(通常为稀硫酸)后，颜色由蓝变黄，应在30分钟内于相应波长(如450nm，并参考630nm作为参比波长)读取OD值。读取前，用无尘纸擦干板底部的冷凝水或污迹。
 

　　八、禁忌事项
 

　　1、本检测盒内禁止使用过期试剂。
 

　　2、禁止本试剂盒内的试剂与其他试剂或活性物质混合使用。
 

　　3、禁止口服或其他接触本试剂盒内的试剂。如发生皮肤敏感现象或可能影响人体内部健康，应进行医学干预。
 

　　九、适用范围
 

　　本检验盒被广泛运用于检测各类疾病，如传染病、自身免疫性疾病，肿瘤标志物、突变基因等。
 

　　十、质控
 

　　在正常操作中，该检测盒可保证准确性和可重复性。如果使用中发现问题，请先尝试实验操作流程，如仍然无法解决，可向生产厂家进行垂询。
 

　　以上就是对Elisa酶联免疫试剂盒的说明书，希望各位用户在使用本试剂盒时一定要加倍谨慎，按照说明书操作，以确保检测结果准确无误。