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实时荧光PCR试剂盒|百科

更新日期: 2024-03-13
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  实时荧光PCR是一种高效、快速、灵敏的核酸检测技术,广泛应用于医药、食品安全、环境监测等领域。实时荧光PCR试剂盒是分析的常用试剂,本说明书将详细介绍其使用方法和注意事项。
 
  一、实时荧光PCR试剂盒组成
 
  1.TaqDNA聚合酶:用于DNA的扩增,负责将引物与模板DNA的单链DNA酶加速退化并使其DNA合成。
 
  2.PCR反应缓冲液:含有适当的缓冲剂,pH9.0,用于维持PCR反应体系的酸碱度,包含MgCl2及其它试剂,在PCR反应中也是扩增的重要条件之一。
 
  3.dNTPs混合物:包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种核苷酸,是DNA分子的构成单位和扩增反应的原料。
 
  4.SYBRGreenI染料:用于荧光定量的染料。
 
  5.引物:包括前向和反向引物,定位于待扩增的基因序列5’端和3’端;
 
  二、试剂盒存储
 
  实时荧光PCR试剂盒应在-20℃下储存,避免阳光直射和高温。试剂从冷冻箱取出后,空冰盒应放回-20℃冰箱中保存;反复冻融次数不宜过多,应遵循一次性使用的原则。
 
  三、试剂配制
 
  1.TaqDNA聚合酶
 
  将试剂盒中的TaqDNA聚合酶稀释至10U/μL,如果使用种类不同的TaqDNA聚合酶,需按照不同试剂盒的说明书配制浓度。
 
  2.PCR反应缓冲液
 
  取10XPCR反应缓冲液一袋,加入适量的双蒸水再混合融合,在处理前摇匀。
 
  3.dNTPs混合液
 
  将试剂盒中的dNTPs混合液稀释至各1mM浓度,即每个dNTPs的表面浓度为10mM。
 
  4.引物
 
  引物需由用户根据需要设计并合成,最佳浓度为0.2μM,初次扩增可以进行浓度梯度PCR。
 
  四、PCR反应体系
 
  PCR反应体系根据不同试剂盒而异,但以下条件必须满足:
 
  1.反应总体积为20μL;
 
  2.TaqDNA聚合酶浓度为0.02U/μL;
 
  3.浓缩PCR缓冲液为10X,含有适量的镁离子,按实验设定的模板DNA浓度进行配制;
 
  4.引物浓度为0.2μM;
 
  5.dNTPs浓度均为1mM。
 
  五、实验操作
 
  1.取模板DNA
 
  提取模板DNA应避免污染,可通过UV检测浓度。
 
  2.根据扩增位点设计合适的引物
 
  应合理设计引物,确保引物的特异性、合适的长度、最佳的表面浓度、最适的扩增温度、避免二聚体生成等。不同种类的引物按不同的扩增步骤使用,避免混合误判。同时,应使用专业的引物设计软件,如Primer3、Oligo等,确定引物序列。
 
  3.PCR反应设置
 
  根据实验需要进行PCR反应体系设置,并通过实验室实验验证修正,确保反应系统的准确性和稳定性。反应过程中应进行一次性使用、避免污染、使用厌氧比色卡等方法进行检测控制。
 
  4.扩增优化
 
  对PCR反应能否成功,引物浓度、反应缓冲液pH值、MgCl2浓度、反应温度和时间等条件均有很大影响,应花费相应的时间进行优化,并针对不同的DNA片段进行个性化优化。
 
  5.片段纯化和测序
 
  提取PCR产物,并将其用试剂盒进行纯化;成品片段用测序仪进行检测,样品需要通过ABI310测序仪检测、测序质量检测、样品的星号,出栏和质量分数具有较高的强相关性。对出现荧光异常需开发相关处理规则和标准化解释方法,确保检测的准确性。
 
  六、注意事项
 
  1.试剂盒应避免长时间在高温环境下存放,否则可能导致试剂盒中的部分试剂失效;
 
  2.PCR反应的准备和加药时,应使用专门的工具,在实验室避免交叉污染;
 
  3.扩增条件须符合说明书说明,必须按照说明书中的条件严格执行,否则可能导致试剂盒效果不佳;
 
  4.试剂盒内各部分试剂的含量应按说明书标记为准,避免误操作导致实验失败。
 
  七、结论
 
  实时荧光PCR试剂盒是提高检测效率和准确性的重要工具。通过科学准确地使用和操作,可确保扩增效果和结果的准确性。

 


 
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