实时荧光PCR是一种高效、快速、灵敏的核酸检测技术，广泛应用于医药、食品安全、环境监测等领域。实时荧光PCR试剂盒是分析的常用试剂，本说明书将详细介绍其使用方法和注意事项。
一、实时荧光PCR试剂盒组成
1.TaqDNA聚合酶：用于DNA的扩增，负责将引物与模板DNA的单链DNA酶加速退化并使其DNA合成。
2.PCR反应缓冲液：含有适当的缓冲剂，pH9.0，用于维持PCR反应体系的酸碱度，包含MgCl2及其它试剂，在PCR反应中也是扩增的重要条件之一。
3.dNTPs混合物：包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种核苷酸，是DNA分子的构成单位和扩增反应的原料。
4.SYBRGreenI染料：用于荧光定量的染料。
5.引物：包括前向和反向引物，定位于待扩增的基因序列5’端和3’端；
二、试剂盒存储
实时荧光PCR试剂盒应在-20℃下储存，避免阳光直射和高温。试剂从冷冻箱取出后，空冰盒应放回-20℃冰箱中保存；反复冻融次数不宜过多，应遵循一次性使用的原则。
三、试剂配制
1.TaqDNA聚合酶
将试剂盒中的TaqDNA聚合酶稀释至10U/μL，如果使用种类不同的TaqDNA聚合酶，需按照不同试剂盒的说明书配制浓度。
2.PCR反应缓冲液
取10XPCR反应缓冲液一袋，加入适量的双蒸水再混合融合，在处理前摇匀。
3.dNTPs混合液
将试剂盒中的dNTPs混合液稀释至各1mM浓度，即每个dNTPs的表面浓度为10mM。
4.引物
引物需由用户根据需要设计并合成，最佳浓度为0.2μM，初次扩增可以进行浓度梯度PCR。
四、PCR反应体系
PCR反应体系根据不同试剂盒而异，但以下条件必须满足：
1.反应总体积为20μL；
2.TaqDNA聚合酶浓度为0.02U/μL；
3.浓缩PCR缓冲液为10X，含有适量的镁离子，按实验设定的模板DNA浓度进行配制；
4.引物浓度为0.2μM；
5.dNTPs浓度均为1mM。
五、实验操作
1.取模板DNA
提取模板DNA应避免污染，可通过UV检测浓度。
2.根据扩增位点设计合适的引物
应合理设计引物，确保引物的特异性、合适的长度、最佳的表面浓度、最适的扩增温度、避免二聚体生成等。不同种类的引物按不同的扩增步骤使用，避免混合误判。同时，应使用专业的引物设计软件，如Primer3、Oligo等，确定引物序列。
3.PCR反应设置
根据实验需要进行PCR反应体系设置，并通过实验室实验验证修正，确保反应系统的准确性和稳定性。反应过程中应进行一次性使用、避免污染、使用厌氧比色卡等方法进行检测控制。
4.扩增优化
对PCR反应能否成功，引物浓度、反应缓冲液pH值、MgCl2浓度、反应温度和时间等条件均有很大影响，应花费相应的时间进行优化，并针对不同的DNA片段进行个性化优化。
5.片段纯化和测序
提取PCR产物，并将其用试剂盒进行纯化；成品片段用测序仪进行检测，样品需要通过ABI310测序仪检测、测序质量检测、样品的星号，出栏和质量分数具有较高的强相关性。对出现荧光异常需开发相关处理规则和标准化解释方法，确保检测的准确性。
六、注意事项
1.试剂盒应避免长时间在高温环境下存放，否则可能导致试剂盒中的部分试剂失效；
2.PCR反应的准备和加药时，应使用专门的工具，在实验室避免交叉污染；
3.扩增条件须符合说明书说明，必须按照说明书中的条件严格执行，否则可能导致试剂盒效果不佳；
4.试剂盒内各部分试剂的含量应按说明书标记为准，避免误操作导致实验失败。
七、结论
实时荧光PCR试剂盒是提高检测效率和准确性的重要工具。通过科学准确地使用和操作，可确保扩增效果和结果的准确性。
