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猪伪狂犬病毒实时荧光PCR试剂盒的操作方法

更新日期: 2023-09-19
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病毒DNA的提取:
1.取出已处理的样品、阴性对照和阳性对照,分别加入600µL抽提液(用抽提液之前不要晃动,不要吸到上层保护液),用力颠倒10次混匀,12,000rpm离心10min。
2.取500µL上清置于灭菌离心管中,加入500µL异丙醇,混匀,置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出样品管,室温融化,13,000rpm离心15min。
3.弃上清,沿管壁缓缓加入1mL洗涤液,轻轻旋转一周后倒掉,将离心管倒扣于吸水纸上1min,再将离心管真空抽干15min或37℃烘干。
4.用30µL无菌水溶解沉淀,作为模板备用。
样品制备:
1.样品采集:病死或扑杀的猪,取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、扁桃体、淋巴结等组织;待检活猪,用棉拭子取鼻腔分泌物,置于50%甘油生理盐水中,或用注射器取血5mL,2~8℃保存。(要求送检病料新鲜,严禁反复冻融。)
2.样品处理:
2.1组织样品的处理:称取组织0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理盐水继续磨至无块状物;然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中,8000rpm离心5min,取上清100µL于1.5mL灭菌离心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混匀后37℃温育1h。
2.2全血样品的处理:待血凝后取血清放于离心管中,8000rpm离心5min,取上清100µL于1.5mL灭菌离心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混匀后37℃温育1h。
2.3阳性对照的处理:混匀后取100µL于1.5mL灭菌离心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混匀后37℃温育1h。
2.4阴性对照的处理:混匀后取100µL于1.5mL灭菌离心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混匀后37℃温育1h。
PCR:
1.反应体系:分别取16µLPCR反应液A(用前混匀)、2µLPCR反应液B(用前混匀)和2µL模板DNA,混匀。
2.反应程序:在PCR仪上运行以下程序:94℃3min;94℃30s、55℃30s、72℃30s,35个循环;72℃延伸10min。
电泳:
1.制胶:用50倍稀释的TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。
2.电泳:待胶凝固后,取5µLPCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm的电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳。
3.染色:取50倍稀释的TAE电泳缓冲液30mL,加入10µL染色液,混匀后将胶浸泡30min,于紫外灯下观察结果。
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