PCR核酸扩增实验常见问题

如实验室的扩增产物泄露，造成实验室的污染，那么后果将非常严重。要去除污染，
①首先最重要的是保持通风，保证扩增产物片段能顺利扩散出去；
②其次可采用稀酸处理法，对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；
③再次采用紫外照射法，紫外波长（nm）一般选择254/300nm，需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大；
④最后若污染长时间不能消除，建议更换另外厂家的PCR试剂进行检测。

要判断自己的PCR仪器是否正常，可从以下几方面考虑：
1.仪器开关机，与软件连接是否正常。
2.仪器运行同样的实验所需要的时间是否跟平时一致，由此判断仪器的加热制冷模块是否正常。
3.曲线结果是否呈明显的S型，若曲线异常，如呈曲折上升状，则可能是热盖问题，或者是荧光检测装置出现问题，或者是电压问题。
4.若曲线的荧光值与平时相比，明显降低，则要考虑是否需要更换仪器光源（尤其是卤素灯，其光源寿命约2000h）。
5.若仪器某一孔或几孔的荧光值明显高于其他孔位，则需要考虑仪器的孔槽或检测光路是否受到荧光污染，建议清洗仪器孔槽后并校准后再进行测试。

1）为了保证检测质量，PCR实验室应有充分合理的空间，良好的照明和空调设备。工作环境虽不是检测质量的直接原因，但宽敞舒适的实验室环境将肯定有利于检验质量的保证。
2）合理有效地对仪器设备进行管理，定期做维护和校准，使其处于一个良好的状态。例如，定期校准移液器，使其保持足够的准确度和精密度。定期维护荧光定量PCR仪的光学系统和反应孔间温度差异，使其保持在良好状态和允许的范围内。此外，还包括天平，离心机，冰箱等设备的管理。
3）理想的试剂：主要有内外两个因素，内在因素包括标本处理方法，用于核酸扩增的原材料及方法学设计等。外出因素包括试剂盒的运输和保存中的问题。
4）标准化操作流程：完整的PCR程序由标本采集，运送，保存，编号，试剂准备，核酸提取，扩增和产物检测，结果分析和报告等诸多环节，建立科学和与本实验室配套的SOP文件，严格按SOP进行操作。
5）主要污染源和防污染措施：PCR的主要污染源有标本中的大量待测微生物，克隆质粒，大量存在实验室中的特定微生物以及以前扩增产物的残留污染等。这些都是实验室最容易造成假阳性的污染。因此，必须严格分区实验室及遵守工作流程，使用化学清洁实验台面，使用紫外线照射和UNG方法消除扩增产物污染等等。
6）进行室内和室间质量控制，室内质量控制可以确保实验室室内测定质量的一致性，室间质量控制可以提供将实验室测定情况与一室间和客观标准进行回顾性比较的数据。

实时荧光定量PCR扩增曲线包括基线期，指数扩增期，线性扩增期和扩增平台期，标准的曲线应该呈典型的S型。不规则曲线可以根据曲线的具体情况来分析：
1）曲线呈斜线上升原因：热盖失灵或热盖没盖紧，导致控温不准、液体挥发。解决办法:更换仪器热盖或将热盖盖紧。
2）扩增曲线分成两段（断裂）原因：基线的终点大于Ct值，通常是因为模板DNA浓度偏高，CT值< 15，而基线仍然取3-15，其中包含部分扩增信号，导致曲线被压下去。解决方法：减小基线终点，至Ct值前4个循环，重新分析数据。
3）直线扩增曲线，某些样本出现直线扩增曲线原因：探针部分降解解决办法:建议更换试剂进行测试。
4）曲线平台期下掉原因：盖子没盖紧解决办法:PCR反应管盖子盖上后，检查盖子是否盖紧。