鲨鱼源性成分（Shark）荧光PCR核酸检测试剂盒

鲨鱼源性成分(Shark)荧光PCR核酸检测试剂盒说明书

【产品名称】

通用名称：​鲨鱼源性成分(Shark)​核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)

Name   ：Shark nucleic acid detection kit (fluorescence-PCR)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

动物源性成分广泛分布于食品、饲料、化妆品等，与人们的生活息息相关，其中食品和饲料所占的比例大。肉及肉制品掺假成为世界各国共同关注的热点问题，肉食品及其饲料的安全隐患直接关系到人类的安危。近几十年来，以PCR技术为核心的动物源性成分检测获得了广泛应用。

本试剂盒适用于动物组织以及食品、饲料等样本中鲨鱼源性成分的检测。

【检验原理】

本试剂盒对鲨鱼源性成分基因保守区设计特异性的引物和探针[1-3]，用荧光 PCR 技术对核酸进行体外扩增检测，从而达到快速检测之目的。

【试剂组成】

名 称 规 格

酶液 50μL×1 管

Chicken 反应液 1.0mL×1 管

Chicken 阳性质控品 50μL ×1 管

阴性质控品 250μL ×1 管

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次。有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

取动物组织及其制品、食品或饲料约 1g。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃。但不能超过6个月，标本运送应采用0℃。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理：

取动物组织及其制品、食品或饲料约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。

1.2DNA 提取

DNA 的提取推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的DNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2判断

a)检测通道 Ct 值＜30.0，有 FAM 荧光信号检出，并出现明显的扩增曲线，判断样品为阳性。

b)当 30.0≤Ct 值≤35.0 时，且有明显的扩增曲线时，则需重复实验。再次扩增后检测体系的Ct 值仍≤35.0，且有明显的扩增曲线，则判定该样品含有相应的动物源性成分。当再次扩增后，检测体系 Ct 值＞35.0，或无明显的扩增曲线，则判定该样品不含相应的动物源性成分。

6.检测方法的局限性

1）样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2）样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3）阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4）病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5）不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6）试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或   定量检测不准确的结果；

7）本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

7.质控标准

a)空白对照：无FAM 荧光信号检出或 Ct 值≥35.0，未出现典型的扩增曲线。

b)阴性对照：无FAM 荧光信号检出或 Ct 值≥35.0，未出现典型的扩增曲线。

c)阳性对照：有 FAM 荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，Ct 值＜30.0。

d)以上应同时满足，否则本次实验无效。

【注意事项】

1）所有操作严格按照说明书进行；检验过程中，参照《GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测》的规定进行。

2）试剂盒内各种组分使用前应自然融化，混匀并短暂离心；

3）反应液应避光保存；

4）反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5）使用一次性吸头、一次性手套和各区工作服；

6）样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7）实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8）试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全   通则》进行处理。

【参考文献】

[1]商务部. SB/T 10923-2012 肉及肉制品中动物源性成分的测定实时荧光 PCR 法[S]. 北京:中国标准出版社, 2012.

[2]王琰. 兔源性食品的PCR-mtDNA 鉴别[J]. 山东师范大学, 2013.

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