鸭源性成分Cytb基因Duck-Cytb荧光PCR试剂盒说明书
【产品名称】
通用名称:鸭源性成分Cytb基因(Duck-Cytb)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)
Name :Duck-Cytb Gene Nucleic Acid Detection Kit for Duck-Cytb Gene (Fluorescence-PCR)
【包装规格】48T/盒
【预期用途】
动物源性成分广泛分布于食品、饲料、化妆品等,与人们的生活息息相关,其中食品和饲料所占的比例大。肉及肉制品掺假成为世界各国共同关注的热点问题,肉食品及其饲料的安全隐患直接关系到人类的安危。近几十年来,以PCR技术为核心的动物源性成分检测获得了广泛应用。
本试剂盒适用于动物组织以及食品、饲料等样本中鸭源性成分Cytb基因的检测。
【检验原理】
本试剂盒对鸭源性成分Cytb基因保守区设计特异性的引物和探针[1-3],用荧光 PCR 技术对核酸进行体外扩增检测,从而达到快速检测之目的。
【试剂组成】
注:
1)不同批号试剂不能混用。
2)试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次。有效期 12 个月。
【标本采集】
取动物组织及其制品、食品或饲料约 1g。
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃。但不能超过6个月,标本运送应采用0℃。
【使用方法】
1.样品处理(样本处理区)
1.1样本前处理:
取动物组织及其制品、食品或饲料约 1g,手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中, 8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。
1.2DNA 提取
DNA 的提取推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的DNA 提取试剂盒(离心柱提取法),请严格按照试剂盒说明书进行操作。
2.试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;样品每满 7 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
5.结果分析判定
5.1结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
5.2判断
a)检测通道 Ct 值<30.0,有 FAM 荧光信号检出,并出现明显的扩增曲线,判断样品为阳性。
b)当 30.0≤Ct 值≤35.0 时,且有明显的扩增曲线时,则需重复实验。再次扩增后检测体系的Ct 值仍≤35.0,且有明显的扩增曲线,则判定该样品含有相应的动物源性成分。当再次扩增后,检测体系 Ct 值>35.0,或无明显的扩增曲线,则判定该样品不含相应的动物源性成分。
6.检测方法的局限性
1)样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
2)样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
3)阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
4)病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
5)不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
6)试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或 定量检测不准确的结果;
7)本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
7.质控标准
a)空白对照:无FAM 荧光信号检出或 Ct 值≥35.0,未出现典型的扩增曲线。
b)阴性对照:无FAM 荧光信号检出或 Ct 值≥35.0,未出现典型的扩增曲线。
c)阳性对照:有 FAM 荧光信号检出,并出现典型的扩增曲线,Ct 值<30.0。
d)以上应同时满足,否则本次实验无效。
【注意事项】
1)所有操作严格按照说明书进行;检验过程中,参照《GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测》的规定进行。
2)试剂盒内各种组分使用前应自然融化,混匀并短暂离心;
3)反应液应避光保存;
4)反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
5)使用一次性吸头、一次性手套和各区工作服;
6)样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
7)实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
8)试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全 通则》进行处理。
【参考文献】
[1]商务部. SB/T 10923-2012 肉及肉制品中动物源性成分的测定实时荧光 PCR 法[S]. 北京:中国标准出版社, 2012.
[2]王琰. 兔源性食品的PCR-mtDNA 鉴别[J]. 山东师范大学, 2013.
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