甲型流感病毒H1N1亚型(IAV-H1N1)荧光探针PCR核酸检测试剂盒

甲型流感H1N1亚型IAV-H1N1荧光PCR试剂盒说明书

【产品名称】

商品名称：甲型流感病毒 H1N1 (IAV-H1N1) 核酸检测试剂盒 (荧光-PCR 法)

Name ：Influenza A virus subtype H1N1 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

甲型流感H1N1是一种RNA病毒，属于正黏液病毒科。它的宿主是犬科动物、鸟类和一些哺乳动物。几乎所有甲型的 H1N1 病毒已被隔离，野生鸟类出现疾病属罕见。有些 H1N1 病毒引起严重的疾病大多发生于家禽和宠物方面，而人类却很少出现。但经过鸟类和犬科动物为主的哺乳动物的传播和变异，这可能导致疫情或人类流感大面积传播。

本试剂盒适用于检测鼻咽拭子、气管分泌物等标本中的甲型流感病毒 H1N1RNA，适用于甲型流感病毒 H1N1 型感染的辅助诊断及流行病学调查。

【检验原理】

本试剂盒根据甲型流感病毒 H1 型 HA 基因、N1 型的 NA 基因分别设计的特异性引物和荧光探针[1-3]，用一步法荧光 RT-PCR 技术对甲型流感病毒 H1N1 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过5次，有效期9个月。

【适用仪器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等荧光定量PCR检测仪。

【标本采集】

患病动物：鼻咽咽拭子、气管分泌物；血液：用一次性无菌注射器抽取静脉血

2mL。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标

本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

鼻咽棉拭、气管分泌物取 100μl。血液样品，3000rpm 离心 5min，吸取 100μL 上层血清，转移至 1.5mL 灭菌离心管

1.2RNA 提取

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的 RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM、ROX， 淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE，

请勿选择 ROX 参比荧光。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

FAM 通道为甲型流感病毒 H1N1 中 H1 基因检测结果，ROX 通道为甲型流感病毒 H1N1 中 N1 基因检测结果

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现明显扩增曲线的样本建议重复试验，重复

试验结果出现 Ct 值≤35.0 和明显扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。

6. 检测方法的局限性

Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或

定量检测不准确的结果；

Ø 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

7. 质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线且无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

【注意事项】

Ø 所有操作严格按照说明书进行；

Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，*混匀并短暂离心；

Ø 反应液应避光保存；

Ø 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区工作服；

Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全

通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 陈棋炯, 孙永祥, 丁军, 等. 应用实时荧光定量 PCR 技术快速检测甲型

H1N1 流感病毒[J]. 中国卫生检验杂志, 2010.

[2] 吉林省质量监督局. DB22∕T 2563-2016 甲型 H1N1 流感病毒核酸检测

Real-timePCR 法[S].

[3] 侯义宏, 王慧煜, 梅琳. 甲型 H1N1 流感病毒一步法多重 RT-PCR 检测方法的

建立[J]. 动物检疫学分会 2010 年学术年会论文集, 2010.

甲型流感H1N1亚型IAV-H1N1荧光PCR试剂盒相关产品：