禽流感病毒H5N1亚型(AIV-H5N1)荧光探针PCR核酸检测试剂盒

禽流感病毒H5N1亚型(AIV-H5N1荧光PCR试剂盒说明书

【产品名称】

商品名称：禽流感病毒 H5N1 亚型（AIV- H5N1）核酸检测试剂盒(实时荧光-PCR 法)

Name ：Diagnostic Kit for Avian Influenza Virus subtype H5N1 RNA (Real-Time PCR Method)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于检测标本中的禽流感病毒 H5N1 亚型 RNA，适用于禽流感病毒 H5N1 亚型感染的辅助诊断及流行病学调查，其检测结果仅供参考。

【检验原理】

本试剂盒用禽流感病毒 H5N1 亚型的特异性引物，分别结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对禽流感病毒 H5N1 亚型 RNA 进行体外扩增检测， 用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

名 称 规 格

酶液 50μL×1 管

AIV-H5N1 反应液 1.0mL×1 管

AIV-H5N1 阳性质控品 50μL ×1 管

阴性质控品 250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 7 次，有效期 9 个月。

【适用仪器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96、Roche Gene 6000、Roche LC480 等荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织；待检活禽，用棉拭子   取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理盐水中。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.05g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。

1.2RNA 提取

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的 RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂 AIV-H5N1 反应液 酶液

用量 20μL 1μL

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道

（Reporter Dye）FAM、ROX， 淬灭通道（Quencher Dye）选择NONE，

请勿选择 ROX 参比荧光。

4.3推荐循环参数设置：

步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

FAM 通道为禽流感病毒 H5 亚型检测结果，ROX 通道为禽流感病毒 N1 亚型检测结果

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现 Ct 值≤35.0 和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。

6.检测方法的局限性

样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

7.质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线且无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

【注意事项】

所有操作严格按照说明书进行；

试剂盒内各种组分使用前应自然融化，*混匀并短暂离心；

反应液应避光保存；

反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

使用一次性吸头、一次性手套和各区工作服；

样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全   通则》进行处理。

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