禽流感病毒H5/H7亚型(AIV-H5/H7)荧光探针PCR核酸检测试剂盒

禽流感病毒H5/H7(AIV-H5/H7)荧光PCR试剂盒说明书

【产品名称】

商品名称：禽流感病毒H5/H7亚型(AIV-H5/H7)?核酸检测试剂盒(实时荧光-PCR法)

Name ：Avian influenza virus H5/H7 subtype (AIV-H5/H7) nucleic acid detection kit (real-time fluorescence-PCR)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

禽流感是由A型流感病毒所引起的禽类疾病。禽流感病毒H5/H7(AIV-H5/H7)除了感染禽类外，部分亚型也能够引起人感染或发病。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主，一般对其不致病，当它们传染给其它物种时有时会造成大的发病率和死亡率。

本试剂盒适用于检测标本中的禽流感病毒H5/H7(AIV-H5/H7)，适用于禽流感病毒H5/H7(AIV-H5/H7)?感染的辅助诊断及流行病学调查。

【检验原理】

本试剂盒分别对禽流感病毒H5/H7(AIV-H5/H7)设计特异性的引物和探针，用一步法荧光RT-PCR技术对AIV-H5/H7 RNA进行体外扩增检测。

【试剂组成】

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 7 次，有效期 9 个月。

【适用仪器】

ABI 系列 、安捷伦 MX3000P/3005P 、MJ Opticon2 、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理盐水中。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中， 8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；棉拭子直接取 100 μL 提取。

1.2RNA 提取

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的 RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂 AIV-H7N9 反应液 酶液

用量 20μL 1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2

设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道

（Reporter Dye）FAM、CY5， 淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

FAM 通道为禽流感病毒 H7N9 亚型 H7 基因检测结果，CY5 通道为禽流感病毒H7N9 亚型 N9 基因检测结果

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现明显扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现 Ct 值≤35.0 和明显扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。

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