禽流感病毒H9N6（AIV-H9N6）荧光探针PCR核酸检测试剂盒

禽流感病毒H9N6(AIV-H9N6)荧光PCR试剂盒说明书

【产品名称】

商品名称：禽流感病毒H9N6（AIV-H9N6）核酸检测试剂盒（实时荧光-PCR 法）

英 文 名 ：Avian influenza virus H9N6 (AIV-H9N6) nucleic acid detection kit (real-time fluorescence-PCR)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

禽类的病毒性流行性感冒，是由A型流感病毒引起禽类的一种从呼吸系统到严重全身败血症等多种症状的传染病[1]。其中禽流感病毒H9亚型，不仅可以感染禽类，也可以感染人类，特别是1999年以来，H9N2亚型AIV感染人事件的多次发生[2-3]严重威胁了人类健康、畜牧业生产和畜产品的贸易，其公共卫生意义已引起*的广泛关注[4]。本试剂盒利用实时荧光PCR原理，定性、定量检测禽流感病毒H9亚型，对禽流感病毒H9亚型引起的流感诊断有重要指导意义。

【检验原理】

本试剂盒针对禽流感病毒H9亚型HA基因高度保守区域设计特异性引物和探针， 在反应体系中含禽流感病毒H9亚型基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测    结果的定性、定量分析。

【试剂组成】

名 称 规 格

酶液 50μL×1 管

AIV-H9 反应液 1.0mL×1 管

AIV-H9 阳性质控品 50μL ×1 管

阴性质控品 250μL ×1 管

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理盐水中。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，

8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；棉拭子直接取 100

μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。

1.2RNA 提取

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂 AIV-H9 反应液 酶液

用量 20μL 1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye） FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）

NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号

1 1 cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、

stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，丏明显的扩增曲线。

可疑：检测通道 Ct 值>35.0，丏出现明显曲线的样本建议重复试验，重复试验结果如果同样出现 Ct 值≤35.0 和明显扩增曲线则为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无 Ct 值丏无明显的扩增曲线。

6.质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线丏无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，丏 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.检测方法的局限性

Ø样本检测结果不样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

【注意事项】

Ø所有操作严格按照说明书进行；

Ø试剂盒内各种组分使用前应自然融化，*混匀并短暂离心；

Ø反应液应避光保存；

Ø反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

Ø使用一次性吸头、一次性手套和各区与用工作服；

Ø样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

Ø实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

Ø试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1]WEBSTER R G, BEAN W J, GORMA N O T, et al. Evolution and ecology of influenza A viruses [J] . Microbiol Rev, 1992, 56(1): 152 -179.

[2]GUO Y J, KRAUSS S, SENNE D A, et al. Characterization of the pathogenicity of members of the newly established H9N2 influenza virus lineages in Asia

[J] .Virology, 2000, 267( 2):279 -288.

[3]唐秀英, 付朝阳, 冯菊艳. H9 亚型禽流感的流行不防制[J] . 预防兽医学进展, 2000, 2( 4): 1-3.

[4]郭元吉, 李建国, 程小雯, 等. 禽 H9N2 亚型流感病毒能感染人的发现[J] . 中华实验和临床病毒学杂志, 1999, 13( 2): 105-108.

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