偏肺病毒（hMPV）荧光PCR核酸检测试剂盒

偏肺病毒(hMPV)荧光PCR核酸检测试剂盒

禽戊型肝炎病毒(Avian Hepatitis E Virus，aHEV)是肉种鸡和蛋鸡的一种疾病，该病感染可能表现亚临床症状，伴有较低的死亡率和产蛋率下降，会引起肝脾肿大综合征和大肝大脾病等，因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点：

一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
根据禽戊型肝炎病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
本产品足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

成  份                                                         十孔盒包装

2×qRT-PCR 缓冲液                                  500 μL（棕色管）

10×qRT-PCR酶混合液                               100 μL（红盖）

 ROX染料I                                                 50 μL（棕色管）

ROX染料II                                                  50 μL（棕色管）

荧光PCR模板稀释液                             1mL（亮黄盖）

禽戊型肝炎病毒RT-PCR引物混合液              100 μL（白盖）

禽戊型肝炎病毒RT-PCR阳性对照

（1×10E8拷贝/μL）                                     50 μL（黄盖）

核酸释放剂试用装                               20次（1mL，绿盖）

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供DNA段作为阳性对照。

样品RNA

一、稀释阳性对照（以10E2-10E7这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。

标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR模板稀释液，用带芯枪头，下同）。
在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号（浓度为1×10E4拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。
用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20次免RNA提取的核酸释放剂试用装，

三、设置RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号阳性对照稀释液做模板）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。
在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后后加）：

成分                   N+2个制备所得样品            RT-PCR阴性对照             RT-PCR阳性对照（2-7管）

2×qRT-PCR               10μL                                     10μL                               各10μL

缓冲液

口蹄疫病毒RT-PCR      2μL                                        2μL                               各2μL

引物混合物

50×ROX (见注)           0.4μL                                      0.4μL                             各0.4μL

样品制备所得RNA模板    5.6μL                                   不加                                不加

（来于第8步）

稀释所得6个阳性对照       不加                                    不加                         各5.6μL（2号样到2

（来于第6步）                                                                                           号管，3号样到3号管…）

10×qRT-PCR                   2μL                                      2μL                                 2μL

酶混合液

注:需使用ROX染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用ROX染料II的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

上机后按下面参数进行RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。

如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

偏肺病毒(hMPV)荧光PCR核酸检测试剂盒