您的位置: 网站首页 >> 技术文章 >> RNA提取技术

RNA提取技术

更新日期: 2019-03-04
浏览人气: 3051

细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类,不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白,DNA等杂质,终获得高纯度RNA产物的过程。

RNA提取技术流程

细胞裂解

异硫氰酸胍/苯酚法(TRIZOL)

这是一种传统的RNA提取方法,适用于大部分动植物材料,但对于次生代谢产物较多的植物材料提取RNA效果较差。

该法应用非常广泛,适用于包括动物组织、微生物、培养细胞等在内的各类动物性材料,同时还适用于次生代谢物较少的植物性材料,如幼苗、幼叶等。该法主要应用在动物组织和培养细胞的RNA提取中。

胍盐/β-巯基乙醇法

RNA提取技术适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料。

在这种方法中,胍盐使细胞充分裂解,β-巯基乙醇作为蛋白的变性剂在实验全程中可以抑制RNaseA的活性,保护RNA不被降解。

其它方法

有些植物材料多糖多酚含量较高,如植物果实,番茄的叶子等,有些植物木质化程度较高,如根茎等组织。针对这类材料本公司推出了一种全新的植物总RNA提取试剂,该试剂特别适合于从富含多糖、多酚、淀粉的材料中提取纯度高、完整性好的总RNA,有关的具体步骤将在分论中详细介绍,实验者可根据自己的需要进行选择。

1.样品处理

从各种不同来源样品(如细菌、酵母、血液、动物组织、植物组织和培养细胞),或同一来源样品的不同组织(如植物幼嫩叶片、成熟根、茎等)中提取高质量的RNA,因细胞结构及所含的成分不同,样品预处理的方式也各有差异。

样品的要求

使用新鲜的样品或取样后立即在低温(-20℃或-70℃)冷冻保存的样品,避免反复冻融,因为这会导致提取的RNA降解和提取量下降。

样品预处理方式

植物材料-液氮研磨

动物材料-匀浆、液氮研磨

细菌-溶菌酶破壁

酵母-液氮研磨、玻璃珠处理、混合酶破壁

硅基质吸附法

随着实验方法的改进,现已发展出一种采用吸附材料纯化核酸的方法。目前较常见的有:硅基质吸附材料、阴离子交换树脂和磁珠等。硅基质吸附材料因其具有可特异吸附核酸,使用方便、快捷、不使用有毒溶剂如苯酚等优点,成为核酸纯化的S选。

 

RNA提取技术纯化及获得

纯化要求

RNA样品中不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。排除DNA分子的污染。

纯化方法及沉淀

方法一:有机溶剂抽提法

抽提

在使用RNA提取试剂进行RNA提取时,常使用进行抽提,以去除蔗糖、蛋白等杂质,并促进水相与有机相的分离,从而达到纯化RNA的方法。在本公司的提取RNA的产品中,与TRIzol同型试剂法及其衍生试剂盒。

沉淀

抽提RNA后,一般采用了异丙醇或乙醇来沉淀水相RNA。加入0.6倍水相体积的异丙醇或与水相等体积的异丙醇,室温沉淀20-30分钟,高速离心,可获得RNA沉淀。

溶解沉淀

加入适量RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。

纤维组织

心脏/骨骼肌等纤维组织提取RNA的关键在于*破碎组织。这些组织细胞密度低,单位重量的组织中RNA含量较低,建议增加起始量。此外,一定要在液氮中将组织*磨碎。

蛋白/脂肪含量较高的组织

脑或植物脂肪含量高,酚抽提后,上清含白色絮状物。必须用再次对上清进行抽提。

 

RNA提取技术纯度检测---分光光度计法

通过OD260/280来检测RNA纯度,OD260/230作为参考值。

OD260/280在1.9-2.1之间,可以认为RNA的纯度较好;

OD260/280值小于1.8,则表明蛋白杂质较多;

OD260/280值大于2.2,则表明RNA已经降解;

OD260/230值小于2.0,则表明裂解液中有异硫氰酸胍和β-巯基乙醇法残留。

注意:如果用TE溶解或洗脱RNA,会使OD260/280值偏大。

分享到:
版权所有©2019 上海晅科生物科技有限公司 备案号:沪ICP备19006485号-1
  • 扫一扫,关注我们