荧光定量PCR

　　荧光定量PCR使用说明
　　【试剂盒简介】
　　猪伪狂犬病毒实时荧光PCR试剂盒，采用聚合酶链反应（PCR）技术检测猪血清和组织中的PRV，适用于PRV的检测、诊断和流行病学调查。
　　【原理】
　　提取DNA作为模板，在DNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环，使特异DNA片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA片段进行电泳、染色后，在紫外灯下，肉眼可见DNA片段的扩增带。
　　【试剂盒组份】

注：塑料袋内试剂（阳性对照、蛋白酶K、PCR反应液A和B）-20 ℃冻存，其他室温保存。

　　
　　【荧光定量PCR操作方法】
　　一、病毒DNA的提取
　　1.取出已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入600µL抽提液（用抽提液之前不要晃动，不要吸到上层保护液），用力颠倒10次混匀，12,000rpm离心10min。
　　2.取500µL上清置于灭菌离心管中，加入500µL异丙醇，混匀，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出样品管，室温融化，13,000rpm离心15min。
　　3.弃上清，沿管壁缓缓加入1mL洗涤液，轻轻旋转一周后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min，再将离心管真空抽干15min或37℃烘干。
　　4.用30µL无菌水溶解沉淀，作为模板备用。
　　二、样品制备
　　1样品采集：病死或扑杀的猪，取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、扁桃体、淋巴结等组织；待检活猪，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于50%甘油生理盐水中，或用注射器取血5mL，2～8℃保存。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。）
　　2样品处理：
　　2.1组织样品的处理：称取组织0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心5min，取上清100µL于1.5mL灭菌离心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。
　　2.2全血样品的处理：待血凝后取血清放于离心管中，8000rpm离心5min，取上清100µL于1.5mL灭菌离心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。
　　2.3阳性对照的处理：混匀后取100µL于1.5mL灭菌离心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。
　　2.4阴性对照的处理：混匀后取100µL于1.5mL灭菌离心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。
　　三、PCR
　　1.反应体系：分别取16µLPCR反应液A（用前混匀）、2µLPCR反应液B（用前混匀）和2µL模板DNA，混匀。
　　2.反应程序：在PCR仪上运行以下程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。
　　四、电泳
　　1.制胶：用50倍稀释的TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。
　　2.电泳：待胶凝固后，取5µLPCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm的电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳。
　　3.染色：取50倍稀释的TAE电泳缓冲液30mL，加入10µL染色液，混匀后将胶浸泡30min，于紫外灯下观察结果。
　　【结果判断】
　　阳性对照出现400bp扩增带，阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现400bp扩增带为猪伪狂犬病毒阳性，否则为阴性。
　　【需用但未提供的材料】
　　组织研磨器、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、琼脂糖、灭菌1.5mL离心管和吸头（10µL、200µL、1000µL）。
　　【猪伪狂犬病毒实时荧光PCR试剂盒注意事项】
　　1．本试剂盒有效期为6个月，不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的组分不要混用。
　　2．所有试剂应在规定的温度储存，使用时拿到室温下，使用后立即放回。