荧光探针法PCR试剂盒

【试剂盒组份】

　　注：塑料袋内试剂（阳性对照、RT-PCR反应液A和B）-20℃冻存，裂解液2-8℃冷藏，其他室温保存。

　　【荧光探针法PCR试剂盒操作方法】

　　一、样品制备

　　1样品采集：：病死或扑杀的禽，取肺、脾、脑等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物，放于50%甘油生理盐水中或用注射器取血5mL，2～8℃保存。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。）

　　2.1组织样品的处理：称取组织0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取100µL上清于1.5mL灭菌离心管中。2样品处理：

　　2.2全血样品的处理：待血凝后取100µL血清于1.5mL灭菌离心管中。

　　2.3阳性对照的处理：取阳性对照100µL于1.5mL灭菌离心管中。

　　2.4阴性对照的处理：取阴性对照100µL于1.5mL灭菌离心管中。

　　二、病毒RNA的提取

　　1.取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入450µL裂解液，充分颠倒混匀，室温静置3min。

　　2.加入275µL无水乙醇，轻轻混匀。

　　3.将混合液吸入吸附柱中（吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱），10,000rpm离心1min，弃去收集管中液体，套回收集管。

　　4.向吸附柱中加入500µL洗涤液A，10,000rpm离心1min，弃去收集管中液体，套回收集管。

　　5.向吸附柱中加入500µL洗涤液B，10,000rpm离心1min，弃去收集管中液体，套回收集管。

　　6.空柱10,000rpm离心2min。

　　7.将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5mL离心管中，在膜中央加入30µL洗脱液，室温静置2min，10,000rpm离心1min，获得总RNA。

　　三、RT-PCR

　　1.反应体系：分别取14µLRT-PCR反应液A（用前混匀）、4µLRT-PCR反应液B（用前混匀）和2µL模板RNA，混匀。

　　2.反应程序：在PCR仪上运行以下程序：42℃45min，94℃3min；94℃30s、53℃30s、72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。

　　四、电泳

　　1.制胶：用50倍稀释的TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。

　　2.电泳：待胶凝固后，取5µLPCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm的电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳。

　　3.染色：取50倍稀释的TAE电泳缓冲液30mL，加入10µL染色液，混匀后将胶浸泡30min，于紫外灯下观察结果。

　　【结果判断】

　　阳性对照出现400bp扩增带，阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现400bp扩增带为新城疫病毒阳性，否则为阴性。

　　【需用但未提供的材料】

　　组织研磨器、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、琼脂糖、经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌1.5mL离心管和吸头（10µL、200µL、1000µL）。

　　【注意事项】

　　1．本试剂盒有效期为6个月，不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的组分不要混用。

　　2．所有试剂应在规定的温度储存，使用时拿到室温下，使用后立即放回。

　　3．注意防止试剂盒组分受污染。使用前将塑料袋内试剂瞬离15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。

　　4．严格按试剂盒说明书操作可以获得的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

　　5．RNA提取过程中，应戴口罩、勤换手套，尽量缩短操作时间。

　　6．所有接触病料的物品均应合理处理，以免污染实验室。