多重荧光探针PCR检测试剂盒

多重荧光探针PCR检测试剂盒说明书

【产品名称】

商品名称：禽流感病毒 H7N9 (AIV-H7N9)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)

Name ：Avian Influenza virus subtype H7N9 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

禽流感是由 A 型流感病毒所引起的禽类疾病。AIV 除了感染禽类外，部分亚型也

能够引起人感染或发病。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主，一般对其不致病，当它

们传染给其它物种时有时会造成大的发病率和死亡率。2013 年我国*报道了人感

染 H7N9 型 AIV，至 2015 年有 571 例感染，212 人死亡。H7N9 AIV 对禽类表现低

致病性，它引起家禽很轻微的或不引起临床症状，但对人却表现很高的致病性[1]。

本试剂盒适用于检测标本中的禽流感病毒 H7N9，适用于禽流感病毒 H7N9 感染

的辅助诊断及流行病学调查。

【检验原理】

本试剂盒分别对禽流感病毒 H7N9 亚型的 HA 和 NA 基因设计特异性的引物和探

针[2-3]，用一步法荧光 RT-PCR 技术对禽流感病毒 H7N9 RNA 进行体外扩增检测，用

于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

名 称 规 格

酶液 50μL×1 管

AIV-H7N9 反应液 1.0mL×1 管

AIV-H7N9 阳性质控品 50μL ×1 管

阴性质控品 250μL ×1 管

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 7 次，有效期 9 个月。

【适用仪器】

ABI 系列 、安 捷伦 MX3000P/3005P 、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织；待检活禽，用棉拭子取

呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理盐水中。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本

运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨

器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，

8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；棉拭子直接取 100

μL 提取。

1.2RNA 提取

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的 RNA 提取试剂盒（离心柱提

取法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对

照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂 AIV-H7N9 反应液 酶液

用量 20μL 1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反

应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道

（Reporter Dye）FAM、CY5， 淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE，ABI

系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现

整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调

节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动

阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

FAM 通道为禽流感病毒 H7N9 亚型 H7 基因检测结果，CY5 通道为禽流感病毒

H7N9 亚型 N9 基因检测结果

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现明显扩增曲线的样本建议重复试验，重复试

验结果出现 Ct 值≤35.0 和明显扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。

6. 检测方法的局限性

Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定

量检测不准确的结果；

Ø 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

7. 质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线且无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

【注意事项】

Ø 所有操作严格按照说明书进行；

Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，*混匀并短暂离心；

Ø 反应液应避光保存；

Ø 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区工作服；

Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通

则》进行处理。

【参考文献】

[1] Morens D M, Taubenberger J K, Fauci A S. H7N9 avian influenza A virus and the perpetual challenge of potential human pandemicity [J]. MBio，2013, 4(4): e00445-13. [2] 罗思思, 谢芝勋, 刘加波, 等. H7N9 亚型 AIV 双重实时荧光定量 RT-PCR 检测方

法的建立[J]. 动物医学进展, 2013, 34(12):1-5. [3] 徐晓龙, 包红梅, 马 勇, 等. H7 和 N9 亚型及 A 型流感病毒多重荧光 RT-PCR 检

测方法的建立[J].中国预防兽医学报, 2014, 12, 36: 939-942.

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