猪链球菌2型/副猪嗜血杆菌/传染性胸膜肺炎放线杆菌（SS-2/HPS/APP）荧光探针PCR核酸检测

猪链球血放线菌SS-2/HPS/APPPCR荧光试剂盒说明书

【产品名称】

商品名称：猪链球菌2型/副猪嗜血杆菌/传染性胸膜肺炎放线杆菌（SS-2/HPS/APP）核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)?

Name ：Streptococcus suis serotype 2 / Haemophilus influenzae / Actinobacillus pleuropneumoniae (SS-2/HPS/APP) nucleic acid detection kit (fluorescent -PCR method)?

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

禽流感是由 A 型流感病毒所引起的禽类疾病。AIV 除了感染禽类外，部分亚型也能够引起人感染或发病。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主，一般对其不致病，当它们传染给其它物种时有时会造成大的发病率和死亡率。2013 年我国*报道了人感染 H7N9 型 AIV，至 2015 年有 571 例感染，212 人死亡。H7N9 AIV 对禽类表现低致病性，它引起家禽很轻微的或不引起临床症状，但对人却表现很高的致病性[1]。

本试剂盒适用于检测标本中的禽流感病毒 H7N9，适用于禽流感病毒 H7N9 感染的辅助诊断及流行病学调查。

【检验原理】

本试剂盒分别对禽流感病毒 H7N9 亚型的 HA 和 NA 基因设计特异性的引物和探针[2-3]，用一步法荧光 RT-PCR 技术对禽流感病毒 H7N9 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

名 称 规 格

酶液 50μL×1 管

AIV-H7N9 反应液 1.0mL×1 管

AIV-H7N9 阳性质控品 50μL ×1 管

阴性质控品 250μL ×1 管

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 7 次，有效期 9 个月。

【适用仪器】

ABI 系列 、安 捷伦 MX3000P/3005P 、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理盐水中。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；棉拭子直接取 100μL 提取。

1.2RNA 提取

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的 RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对

照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂 AIV-H7N9 反应液 酶液

用量 20μL 1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反

应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM、CY5， 淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE，ABI系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

FAM 通道为禽流感病毒 H7N9 亚型 H7 基因检测结果，CY5 通道为禽流感病毒

H7N9 亚型 N9 基因检测结果

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现明显扩增曲线的样本建议重复试验，重复试

验结果出现 Ct 值≤35.0 和明显扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。

6. 检测方法的局限性

Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

Ø 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

7. 质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线且无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

【注意事项】

Ø 所有操作严格按照说明书进行；

Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，*混匀并短暂离心；

Ø 反应液应避光保存；

Ø 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区工作服；

Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] Morens D M, Taubenberger J K, Fauci A S. H7N9 avian influenza A virus and the perpetual challenge of potential human pandemicity [J]. MBio，2013, 4(4): e00445-13. [2] 罗思思, 谢芝勋, 刘加波, 等. H7N9 亚型 AIV 双重实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立[J]. 动物医学进展, 2013, 34(12):1-5. [3] 徐晓龙, 包红梅, 马 勇, 等. H7 和 N9 亚型及 A 型流感病毒多重荧光 RT-PCR 检测方法的建立[J].中国预防兽医学报, 2014, 12, 36: 939-942.

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