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产品名称:

五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒PCR法

产品型号: 96T 产品时间: 2022-04-24
五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒PCR法可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增,仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化,自动判读结果。本产品用于致泻大肠埃希氏菌的检测。检出限为 103 CFU/ml。

产品概述

五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒PCR法

u  产品说明

五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒PCR法可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增,仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化,自动判读结果。本产品用于致泻大肠埃希氏菌的检测。检出限为 103 CFU/ml

    产品组成(96 测试)

222.png

 

   所需仪器

ABI BioRadTaKaRa PCR 扩增仪,电泳仪,凝胶成像仪等电泳配套设备使用荧光定量 PCR 仪进行定性判读时则无需电泳设备

   自备耗材和仪器

①灭菌 1.5mL 2.0mL 离心管;②冰盒;③移液器0.5-10μL10-100μL100-1000μL及配套灭菌吸头;④ 离心机;⑤涡旋混匀器;⑥金属浴。

   样品处理

参照《GB4789.6—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》中的操作步骤进行前增菌。建议使用试剂配套细菌基因组 DNA 提取系列产品。

   实验操作

1.试剂配制(试剂配制区,放置于冰盒中进行取出各管试剂,将试剂*解冻,离心 30s。取 12×(所待检样品数+3)PCR 反应管,按 12 个一组排列并编号,依次向各管中加入 23μL 12 种反应液。

2.添加模板(样本制备区,放置于冰盒中进行向每管反应液中分别加入 2μL 模板(或直接使用无菌吸头挑取少许待检菌落至反应管中)。加样示例:(有 N 个待测样品

(N+3)12 个一组的反应管,按顺序第一组 12 管中全部加入 2μL NG-DW,第二组 12管中全部加入 2μLNG-Ecoli,第三组 12 管中全部加入 2μL 的样品 1 模板,第四组 12 管中全部加入 2μL 的样品 2 模板,…,最后12 管中全部加入 2μL PG-Ecoli

盖好 PCR 管盖后,涡旋混匀 30s,离心 1min,立即进行 PCR 扩增反应。

3.扩增反应(扩增及产物分析区

按下列条件设置扩增反应:(如需使用荧光法进行检测请选择 FAM 通道

PCR 循环

荧光收集位点

37

10 分钟

1 个循环

95℃

10 分钟

1 个循环

95℃

30

 

30 个循环

63 ℃

30

72℃

90

72℃

5 分钟

1 个循环

 

4.产物电泳(扩增及产物分析区

称量 4. 0g 琼脂糖粉,加入至 200 mL 1×TAE 电泳缓冲液中,充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾,直到琼脂糖粉*融化形成清亮透明的溶液。待琼脂糖溶液冷却至 60右时,加入溴化乙锭( EB )至终浓度为 0.5μg/mL, 充分混匀后,轻轻倒入已放置好梳子的模具中,凝胶长度要大于 10cm,厚度宜为 3mm~5mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡,用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。当琼脂糖凝胶*凝结硬化后,轻轻拔出梳子,小心将胶块和胶床放入电泳槽中,样品孔放置在阴。向电泳槽中加入 1×TAE 电泳缓冲液,液面高于胶面 1mm~2mm。将5μL PCR 产物与 1μL 6×上样缓冲液混匀后,用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔,小心上样于孔中;阳性对照的 PCR 反应产物加入到最后一个泳道;第一个泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通电泳仪电源,根据公式电压=电泳槽正负极间的距离(cm×5V/cm 计算并设定电泳仪电压数值;启动电压开关,电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。电泳 30min~45min 后,切断电源。取出凝胶放入凝胶成像仪中观察结果,拍照并记录数据。

u  可使用 Gold viewGal-Rad 等等效的核酸荧光染料替代 EB

u  推荐使用 DNA MarkerDL2000 100bp ladder,等可指示 100bp~1500bp 条带的 Marker

    结果分析

1.阴阳性判读:

进行电泳检测时,需对比 Marker 进行判断,当目的靶标对应位置出现单一显著条带时可判断该靶标为阳性; 否则为该靶标检测为阴性。使用荧光定量 PCR 仪检测时,检测孔Ct≤30 时判断该孔为阳性;当检测孔Ct30 时, 该检测孔为阴性

示例电泳图

111.png


2.有效性判读:

需同时满足:1.空白对照中所有泳道均为阴性;2.阴性对照中 uidA 泳道阳性,其余泳道阴性;2.阳性对照中所有泳道阳性,此时可判断实验有效。如无法满足上述条件,则实验无效,需重复实验;如重复后结果仍为无效,请于本公司技术支持联系。

3.结果判读:

在实验有效的情况下,可根据下表进行判读:

 

大肠埃希氏菌类别

目标条带的种类组合

EIEC

ipaH(+)

 

 

uidA

(+/-)

EAEC

aggRastApic 中一条或一条以上阳性

EPEC

bfpBeae(+stx1stx2

STEC/EHEC

stx1stx2 中一条或一条以上阳性,eae+/-bfpB-)

ETEC

ltstpsth 中一条或以上阳性

u  97%以上大肠埃希氏菌为 uidA 阳性,可参考阴性对照中该基因检测结果判断扩增效果;

u  当结果判定为EPEC 阳性时,若 bfpB 靶标为阳性则说明样品含有典型EPEC;若 bfpB 靶标为阴性则说明样品为非典型EPEC

当结果判定为STEC/EHEC 阳性时,若 eae 靶标为阳性则说明样品含有典型EHEC;若 eae 靶标为阴性则说明样品为非典型EHEC


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