技术讲堂—抗体相关知识（1）

技术讲堂—抗体相关知识（1）

抗体(antibody)是生物体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白(Ig)。按抗体的来源，可将其分为天然抗体和人工制备的抗体，是通过对特定生物体免疫接种特定抗原物质后而获得。人工免疫动物制备的抗体应用甚为广泛，既可以用于科学研究，也可以用于疾病的预防、诊断和治疗。

一、抗体的基本结构
经x线晶体衍射结构分析发现，抗体Ig由四条多肽链组成，各肽链之间由数量不等的链间二硫键连接。Ig可形成“Y”字型结构，称为Ig单体，是构成抗体的基本单位。
（一）重链和轻链

天然Ig分子含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain, H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain, L)。同一Ig分子中的两条H链和两条L链的氨基酸组成*相同。
1. 重链分子量为50000～75000，由450～550个氨基酸残基组成。重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，其抗原性也不同。据此，可将抗体Ig分为5类(class)，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE, 其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链，商品化的抗体绝大部分都是IgG。不同类的Ig具有不同的特征，如链内和链间二硫键的数量和位置、结构域的数量及铰链区的长度等均不*相同。即使是同一类的Ig，其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数量、位置也不同，据此又可将同类Ig分为不同的亚类(subclass)。
IgG的亚类
利用不同种属动物制备的IgG存在不同的亚类，常见的不同种属IgG亚类如下：
• 兔: IgG（无亚类）
• 小鼠: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3
• 大鼠: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgM
• 山羊: IgG1, IgG2
在进行某些抗体相关实验(如IF和FCM)的时候，我们常常需要仔细看一下所订购商品化抗体的IgG亚类，以方便我们选择同型对照(isotype control) IgG (即与目的蛋白抗体相同来源种属的相同类型正常IgG)作为抗体的阴性对照进行平行实验，以排除可能的非特异性染色结果。
2. 轻链分子量约为25000，由214个氨基酸残基构成。轻链可分为两种，分别为kappa(κ)链和lambda(λ)链。据此，可将lg分为两型(type)，即κ型和λ型，一个Ig分子上两条轻链的型别总是相同的。生物体内可同时存在κ型和λ型的Ig分子，不同种属生物体内两型轻链的比例不同。正常人血清Ig的κ: λ约为2:1，而在小鼠则为20:1。根据λ链恒定区个别氨基酸的差异，又可将λ链分为λl、λ2、λ3和λ4四个亚型(subtype)。

（二）可变区和恒定区
通过分析不同Ig重链和轻链的氨基酸序列发现，重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将Ig轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region, V区)，占重链1/4，占轻链1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region, C区)，占重链3/4，占轻链1/2。
1．可变区 重链和轻链的V区分别称为VH和VL。VH和VL中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariable region, HVR)或互补决定区(complementarity determining region, CDR), 包括HVR1(CDR1)、HVR2(CDR2) 和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)变化程度更高。VH的3个高变区分别位于29～31、49～58和95～102位氨基酸，而VL的3个高变区分别位于28～35、49～56和91～98位氨基酸。VH和VL的3个CDR共同组成Ig的抗原结合部位(antigen binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。
2．恒定区 重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，例如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3, 而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。

（三）铰链区
铰链区(hinge region)位于CH1与CH2之间，富含脯氨酸，易伸展弯曲，从而改变抗原结合部位之间的距离，有利于抗体结合位于不同位置的抗原表位。铰链区易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，产生不同的水解片段。

抗体的纯化
我们知道，一般免疫血清中含有特异性抗体和非特异性抗体，血清蛋白以及其他各种杂蛋白等，在制备特异性抗体过程中当抗体的效价达到实验预期之后，需要对免疫血清进行纯化提取得到效价更高，特异性更强，稳定性更好的抗体。
目前，大多数商品化抗体使用Protein A或Protein G进行纯化。由于protein A或protein G 可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合。Protein A或protein G 作为配基可以被偶联到琼脂糖凝胶上，当抗血清从中流过时，特异性的IgG就与配基结合，其他杂蛋白则穿流而过。因两种蛋白纯化抗体时对不同宿主的抗体的结合能力不同，我们需要具体情况，分别选择protein A 或protein G, 或者是protein A/protein G组合。一般兔抗（包括单克隆蛋白与多克隆抗体）、小鼠单抗IgG2a、IgG2b、IgG3, 选择用protein A纯化；而小鼠、大鼠和山羊的多克隆抗体、小鼠单抗IgG1、大鼠单抗，则选择用protein G纯化。