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炭疽杆菌pagA cap rpoB基因检测试剂盒(三重荧光PCR)

更新日期: 2022-04-23
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炭疽杆菌pagA cap rpoB基因检测试剂盒(三重荧光PCR)

【产品名称】

通用名称:炭疽杆菌 pagA、cap、rpoB 基因(BaP/C/R)检测试剂盒(三重荧光 PCR 法) Name:Bacillus Anthracis pagA、cap、rpoB gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】

50T/盒

【预期用途】

炭疽是由炭疽杆菌(Bacillus Anthracis, BA)感染引起的一种人兽共患病。BA 在环境中形成芽孢,可长期、稳定地存在于自然界中。由于 BA 的稳定性及其致病性,易引发突发公共卫生事件。目前的 BA 检测方法主要基于病原体的培养、染色镜检、血清学检测等,但这些方法均不适合早期的快速侦检。基于核酸检测的荧光-PCR       技术,因其灵敏度高、操作简单、特异性好,可快速检测炭疽病原,及时控制炭疽疫情。

本试剂盒采用探针法实时荧光定量 PCR 技术,用于水疱内容物、病灶渗出物、分泌物、痰液、呕吐物、粪便、血液、脑脊液以及增菌液中炭疽杆菌的定性检测。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术,对炭疽杆菌的 pagA、cap、rpoB 的基因分别设计特异性引物和特异性探针,用荧光 PCR 技术对炭疽杆菌的 DNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

包装规格

50T/盒

BaP/C/R 反应液

500μL×2 管

酶液

50μL×1 管

BaP/C/R 阳性质控品

50μL ×1 管

阴性质控品

250μL ×1 管

说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

炭疽水疱内容物、炭疽病灶渗出物、分泌物、痰液、呕吐物、粪便、血液、脑脊液等;

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输, 严禁反复冻融。

【使用方法】

1.  样品处理(样本处理区)

1.1  样本前处理

组织样品:每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 200μL 于 1.5mL灭菌离心管中;咽拭子样品直接取 200μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。

1.2  核酸提取

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提取,请按照试剂说明书进行操作。

2.  试剂配制(试剂准备区)

根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性质控品+1 管阳性质控品),每测试反应体系配制如下表:

试剂

BaP/C/R 反应液

酶液

用量(样本数为 N)

20μL

1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21μL/管。

3.  加样(样本处理区)

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀, 短暂离心。

4.  PCR 扩增(核酸扩增区)


4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;

4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;

荧光通道选择:检测通道(Reporter Dye)FAM,Cy5,TXR, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光,选择 None 即可。

4.3 推荐循环参数设置:

步骤

循环数

温度

时间

收集荧光信号

1

1 cycle

95℃

10min

2

40 cycles

94℃

15sec

55℃

30sec

5.  结果分析判定

5.1  结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性质控品),重新分析结果。

5.2  结果判断

FAM 通道为 pagA 基因检测结果,Cy5 通道为 cap 基因检测结果,TXR 通道为 rpoB 检测结果; 阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线;

可疑:检测通道 35<Ct 值≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38,且曲线有明显的增长曲线, 判定为阳性,否则为阴性;

阴性:样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6.  质控标准

阴性质控品:Ct>38 或无 Ct 值显示;

阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。

7.  检测方法的局限性

1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;

2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;

3. 阳性质控品、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;

4. 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;

5. 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;

6. 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;

7. 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1. 所有操作严格按照说明书进行;

2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,*混匀并短暂离心;

3. 反应液应避光保存;

4. 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;

5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;

6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;

7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;

8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【生产企业】

企业名称:上海晅科生物科技有限公司


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