炭疽杆菌pagA cap rpoB基因检测试剂盒(三重荧光PCR)

【产品名称】

通用名称：炭疽杆菌 pagA、cap、rpoB 基因（BaP/C/R）检测试剂盒(三重荧光 PCR 法) Name：Bacillus Anthracis pagA、cap、rpoB gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】

50T/盒

【预期用途】

炭疽是由炭疽杆菌（Bacillus Anthracis, BA）感染引起的一种人兽共患病。BA 在环境中形成芽孢，可长期、稳定地存在于自然界中。由于 BA 的稳定性及其致病性，易引发突发公共卫生事件。目前的 BA 检测方法主要基于病原体的培养、染色镜检、血清学检测等，但这些方法均不适合早期的快速侦检。基于核酸检测的荧光-PCR       技术，因其灵敏度高、操作简单、特异性好，可快速检测炭疽病原，及时控制炭疽疫情。

本试剂盒采用探针法实时荧光定量 PCR 技术，用于水疱内容物、病灶渗出物、分泌物、痰液、呕吐物、粪便、血液、脑脊液以及增菌液中炭疽杆菌的定性检测。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，对炭疽杆菌的 pagA、cap、rpoB 的基因分别设计特异性引物和特异性探针，用荧光 PCR 技术对炭疽杆菌的 DNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

炭疽水疱内容物、炭疽病灶渗出物、分泌物、痰液、呕吐物、粪便、血液、脑脊液等；

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输， 严禁反复冻融。

【使用方法】

1.  样品处理（样本处理区）

1.1  样本前处理

组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 200μL 于 1.5mL灭菌离心管中；咽拭子样品直接取 200μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。

1.2  核酸提取

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。

2.  试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性质控品+1 管阳性质控品)，每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21μL/管。

3.  加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4.  PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM，Cy5，TXR， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

5.  结果分析判定

5.1  结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性质控品)，重新分析结果。

5.2  结果判断

FAM 通道为 pagA 基因检测结果，Cy5 通道为 cap 基因检测结果，TXR 通道为 rpoB 检测结果； 阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38，且曲线有明显的增长曲线， 判定为阳性，否则为阴性；

阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6.  质控标准

阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.  检测方法的局限性

1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3. 阳性质控品、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1. 所有操作严格按照说明书进行；

2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，*混匀并短暂离心；

3. 反应液应避光保存；

4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【生产企业】

企业名称：上海晅科生物科技有限公司