禽腺病毒I群（FADV-I）PCR试剂盒常见问题及解决方案

禽腺病毒I群（FADV-I）PCR试剂盒常见问题及解决方案

一、检测结果异常

1.无目标扩增或扩增效率低

●可能原因：

●核酸提取失败（如样本反复冻融超过5次导致DNA降解）  。

●试剂活性下降（未按-20℃保存或反复冻融超过5次）。

●PCR循环参数设置错误（如退火温度未设为60℃）。

●解决方案：

●优化核酸提取步骤，推荐磁珠法或离心柱法，确保DNA纯度。

●检查试剂保存条件，避免不同批次试剂混用。

●核对仪器参数设置，确认扩增程序为“95℃预变性5分钟，95℃ 15秒/60℃ 30秒，循环40次"。

2.非特异性扩增（假阳性）

●可能原因：

●样本间交叉污染（如未使用滤芯吸头或未区分实验区域）。

●环境气溶胶污染（实验台未彻-底消毒）。

●解决方案：

●使用无菌操作技术，严格划分样本处理区、试剂配制区和扩增区。

●实验后用10%次氯酸或75%酒精消毒操作台，废液按生物危害物处理。

二、操作流程问题

1.样本处理问题

●常见问题：

●活禽泄殖腔拭子未置于50%甘油生理盐水中保存，导致核酸降解 。

●组织样本未低温运输（推荐2-8℃冰袋保存），影响检测准确性。

●解决方案：

●严格按规范保存样本，活禽拭子需浸泡于50%甘油生理盐水，组织样本-20℃冷冻。

2.试剂配制误差

●常见问题：

●预混液未完-全溶解或混匀，导致反应体系不均 。

●加样体积偏差（如未按21μL预混液+4μL样本比例配制。

●解决方案：

●使用前充分溶解试剂并短暂离心，避免气泡干扰 。

●采用精准移液器（如低吸附吸头）控制加样量。

三、仪器与数据分析问题

1.扩增曲线异常

●可能原因：

●反应管密封不严导致蒸发（曲线呈锯齿状或不规则）。

●探针荧光衰减（未避光保存试剂或反复冻融） 。

●解决方案：

●检查PCR管密封性，确保扩增过程无液体损失。

●试剂避光保存，开封后尽快使用。

2.结果判读争议

●常见问题：

●阈值线设置不当（需高于阴性对照荧光信号）。

●可疑样本（Ct值35.0-38.0）未复测直接判读。

●解决方案：

●调整基线参数（Start值3-15，Stop值5-20），手动设定阈值线。

●对可疑样本重复检测，若复测Ct值仍≤38.0则判为阳性。

四、质控标准与验证

●质控失败处理：

●阳性对照无扩增：检查试剂活性或仪器校准（如FAM通道是否开启）。

●阴性对照出现Ct值：排查环境污染或试剂污染，重新提取核酸。

五、其他注意事项

●试剂盒适用范围：仅限科研使用，临床诊断需结合其他检测方法。

●冷链运输要求：试剂需-20℃保存，运输时使用冰袋（2-8℃）。

建议：若问题持续存在，可联系供应商获取技术支持。